Metodyka badań
Hodowla okrzemek
Okrzemki z gatunku Phaeodactylum tricornutum hodowano w pożywce Guillard’a, w skład której wchodziły odpowiednie roztwory podstawowe, tj. mikoelementy: (Na2EDTA (4,16 g); FeCl3∙6H2O (3,15 g); CuSO4∙5H2O (0,01 g); ZnSO4∙7H2O (0,022 g); CoCl2∙6H2O (0,01 g); MnCl2∙4H2O (0,18 g); Na2Mo4∙H2O (0,006 g)) i mieszanina witamin (witamina B12 (0,0005 g); witamina B1 (0,1 g); biotyna (0,0005 g)), a także NaNO3 (0,075 g) (stosowano roztwór 1000-krotnie stężony) i NaH2PO4∙2H2O (0,00565 g) (stosowano roztwór 1000-krotnie stężony) oraz sól morska. Dodatkowo w przypadku hodowli prowadzonej w pożywce zawierającej krzem, w jej skład, jako źródło krzemu wchodził również metakrzemian sodu (Na2SiO3∙9H2O) (30 g). W nawiasie podano masy poszczególnych składników jakie należy odważyć na litr danych roztworów podstawowych.
Przygotowując mieszaninę witamin, po umieszczeniu wszystkich składników w falkonie (poj. 50 ml), poddawano ją filtracji poprzez przeciskanie jałową strzykawką z filtrem mikrobiologicznym o średnicy porów 0,22 μM (z membraną z CME, Bionovo), do jałowego falkonu (poj. 50 ml). 1 ml mieszaniny witamin zamrażano w probówkach typu Eppendorf i przechowywano w temperaturze -20⁰C.
Pożywki sporządzano w kolbach płaskodennych o pojemności 2l. W litrze wody destylowanej umieszczano odpowiednio po 1 ml, każdego z roztworów podstawowych oraz po 16 g soli morskiej. Mieszaninę witamin w objętości 1 ml na 1l pożywki wprowadzano po zautoklawowaniu. Przed umieszczeniem pożywek w autoklawie ustalano ich pH, na poziomie ok. 8,0 za pomocą 1 M r-ru NaOH lub 1 M r-ru HCl.
Przeszczepienie hodowli okrzemek
Przeszczepiając hodowle kierowano się zasadą, że objętość dodawanej hodowli wyjściowej okrzemek powinna stanowić ¼ objętości sporządzonej pożywki. Przykładowo, aby rozpocząć właściwą hodowlę, wcześniej przygotowywano hodowle podstawowe (np. 200 ml pożywki + 50 ml hodowli wyjściowej). Po upływie 7 – 10 dni przeszczepiano je do kolb z pożywką o objętości 800ml (800 ml + 200 ml hodowli) oraz 200 ml (200 ml + 50 ml hodowli – kolejna hodowla podstawowa). Po kolejnych 7 – 10 dniach hodowlę o objętości 1000 ml poddawano zwirowaniu (7 minut, 5000∙g, 4⁰C). Hodowle podstawowe przeszczepiano jak powyżej.
Hodowle prowadzono w zróżnicowanych warunkach, tzn. przy różnym natężeniu światła (91 – 181; 157 – 219; 140 – 192; 59 μmol∙m-2∙s-1) i w różnych temperaturach (12⁰C, 15⁰C, 20⁰C i 23±1⁰C) oraz z dodatkiem lub bez dodatku Na2SiO3∙9H2O. Mieszano je co jeden/dwa dni. W przypadku hodowli prowadzonych w temperaturach 12ºC (z dodatkiem lub bez dodatku Na2SiO3∙9H2O) oraz 15ºC (z dodatkiem Na2SiO3∙9H2O) wirowano je po 5 dniach.
Zbieranie komórek w celu pozyskania barwników
Zbieranie komórek okrzemek różniło się w zależności od rodzaju barwnika, który miał zostać pozyskany. W celu otrzymania Ddx hodowle umieszczano w ciemności na minimum godzinę przed wirowaniem (7 minut, 5000∙g, 4⁰C). Otrzymany materiał pobierano pipetą do falkonu o poj. 15 ml i ponownie wirowano (2 minuty, 5000∙g, 4⁰C). Następnie pobrane komórki mrożono w ciekłym azocie i umieszczano w temperaturze -20⁰C.
Aby pozyskać Dtx przed zwirowaniem hodowle naświetlano przez 75 minut lampą o natężeniu światła 1200 – 1300 μmol∙m-2∙s-1. Kolejne czynności przebiegały analogicznie do tych związanych z poborem komórek zawierających Ddx.
Z litra hodowli pozyskiwano około 700 μl zebranych komórek.
Izolacja barwników cyklu diadinoksantynowego
Przed rozpoczęciem izolacji płytkę z odwróconą fazą do chromatografii cienkowarstwowej umieszczano w suszarce laboratoryjnej w celu tzw. aktywacji (czas: ok. 75 minut, T = 110⁰C). Przygotowywano także komorę chromatograficzną, umieszczając w niej mieszaninę rozpuszczalnikową do HPTLC (metanol:woda:amoniak – 9:1:0,12 (v:v:v)). W trakcie wszystkich poniższych czynności próbkę przechowywano w lodzie i w ciemności.
Po rozmrożeniu osadu (zebranych komórek) dodawano do niego bufor fosforanowy o pH 8 (50mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl) w objętości odpowiadającej objętości osadu. Następnie próbkę poddawano sonikacji (czas: 4 minuty, pulse on: 30; pulse off: 10, amplituda: 35%).
Zsonikowaną próbkę umieszczano w probówkach typu Eppendorff po 500 μl, wytrząsano (vortex) przez około 20 sekund i wirowano (3 minuty, 13 800 rpm, 4⁰C). Po zwirowaniu, do osobnych probówek Eppendorff’a przenoszono nadsącz. Następnie zarówno do probówek Eppendorff’a zawierających nadsącz jak i osad dodawano mieszaninę ekstrakcyjną (chloroform:metanol:amoniak – 1:2:0,004 (v:v:v)) w objętości odpowiadającej objętości zsonikowanej próbki i ponownie wytrząsano (vortex) przez około 20 sekund oraz wirowano (3 minuty, 13 800 rpm, 4⁰C).
Kolejnym etapem było zebranie ekstraktów z probówek Eppendorff’a zawierających osad i nadsącz (dolną frakcję) oraz umieszczenie ich w osobnych probówkach typu Eppendorff. Mieszaninę ekstrakcyjną usuwano gazowym azotem, a po osuszeniu wprowadzano solwent do HPTLC, tj. metanol:woda:amoniak – 9:1:0,12 (v:v:v) (200 μl na 1 ml początkowej objętości próbki – przed sonikacją). Przed rozpoczęciem nakładania próbki na płytkę sprawdzano w badanym materiale zawartość Chla. W tym celu do probówki Eppendorff’a pobierano 20 μl próbki i 1 ml 90% acetonu. Całość wirowano (3 minuty, 13 800 rpm, temp. pokojowa), następnie mierząc absorbancję (750 nm – auto zero, 664 nm i 630 nm), jako odnośnik używano 1 ml 90% acetonu z dodatkiem 20 μl mieszaniny rozpuszczalnikowej do HPTLC (metanol:woda:amoniak – 9:1:0,12 (v:v:v)). Stężenie chlorofilu obliczano wg wzoru:
Chl a = 11,47 ∙ E664 – 0,4 ∙ E630 [μg/ml].
Pozostałą objętość przygotowanej próbki nanoszono za pomocą aplikatora do HPTLC na wcześniej wyjętą aktywowaną płytkę. Używaną strzykawkę dokładnie przepłukiwano stosowanym solwentem do HPTLC (metanol:woda:amoniak – 9:1:0,12 (v:v:v)) oraz metanolem zarówno przed jak i po czynności nanoszenia próbki.
Płytkę z naniesioną próbką umieszczano w komorze chromatograficznej. Po upływie 40 – 45 minut wyjmowano ją i po wyschnięciu ekstrahowano z niej odpowiednie barwniki. Ekstrakcję prowadzono przez zebranie odpowiednich prążków („zeskrobanie” materiału powlekającego płytkę) i potraktowanie 100% acetonem (250 μl). Powstałą zawiesinę wytrząsano (vortex) przez około 20 sekund i wirowano (10 minut, 13 800 rpm, 4⁰C), czynność powtarzano do momentu całkowitej ekstrakcji. W celu określenia czystości otrzymanych barwników wykreślano i analizowano widmo absorpcyjne za pomocą spektrofotometru. Pomiar linii bazowej rejestrowano używając 100% acetonu. Mierząc widmo badanej próbki, w kuwecie umieszczano 700 μl acetonu oraz 70 μl wyizolowanego barwnika. Otrzymany barwnik umieszczano w zamrażarce w temperaturze - 20⁰C (Rys. 7.1.).
Rys. 7.1. Schemat przedstawiający procedurę izolacji barwników cyklu diadinoksantynowego
Oczyszczanie diadinoksantyny
W przypadku otrzymania zanieczyszczonej Ddx, podejmowano działania mające na celu jej oczyszczenie. W tym celu stosowano kilka metod, spośród których tylko jedna okazała się skuteczna. W trakcie każdej z nich sposób wykonania był taki sam, a różnica polegała jedynie na rodzaju zastosowanej mieszaniny ekstrakcyjnej.
Aby sprawdzić, w jakich warunkach rozdział jest najskuteczniejszy używano dwóch płytek: z tlenkiem krzemu i z tlenkiem glinu. Obie płytki (7x12cm) umieszczano w suszarce laboratoryjnej (75 minut, 110⁰C). Następnie po ich ostudzeniu nakładano na nie po 50 μl wyizolowanej Ddx (w acetonie), za pomocą aplikatora TLC.
Płytki z naniesioną próbką umieszczano w zlewce z określoną mieszaniną ekstrakcyjną (odpowiednio I - benzyna ekstrakcyjna:aceton:amoniak 125:5:0,0156 (v:v:v); II - n-propanol:benzyna ekstrakcyjna:amoniak 2,5:97,5:0,12 (v:v:v); i III – aceton:woda:amoniak; 6:4:0,012 (v:v:v)). Po upływie około 20 minut płytki wyjmowano i suszono.
Po dobraniu odpowiedniej mieszaniny ekstrakcyjnej przeprowadzano właściwy proces oczyszczania na płytce preparatywnej TLC. Przygotowanie płytki przebiegało tak jak poprzednio. Na ostudzoną płytkę nakładano całą próbkę z zanieczyszczoną Ddx, wykorzystując do tego celu aplikator TLC. Płytkę z naniesionym barwnikiem umieszczano następnie w komorze chromatograficznej z wcześniej umieszczoną w niej mieszaniną ekstrakcyjną.
Kolejną czynnością było wyjęcie płytki z komory po zaobserwowaniu widocznego rozdziału, ekstrakcja barwnika z płytki 100% acetonem i spektrofotometryczna analiza jego czystości.
Utworzenie liposomów z wbudowaniem do nich odpowiednich barwników cyklu diadinoksantynowego
W celu utworzenia liposomów do badania dynamiki molekularnej techniką elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) wykorzystywano lecytynę jaja kurzego (EYL) (C = 10-4M = 0,1 mM) – w kolejnych etapach planowane jest wykorzystanie lipidów występujących w błonach tylakoidowych okrzemek; znaczniki spinowe: kwas doksylowy-5 (SASL-5) i kwas doksylowy-16 (SASL-16) (C = 10 mM) oraz barwniki cyklu diadinoksantynowego (C = 70μM).
Najpierw w probówce typu Eppendorff umieszczono chloroformową mieszaninę lipidu z jednym ze znaczników oraz wybranym barwnikiem dodawanym na końcu. Poszczególne elementy wprowadzano strzykawką Hamiltona, którą następnie dokładnie przepłukiwano – po lipidach chloroformem i metanolem, natomiast po pozostałych składnikach tylko metanolem.
Z tak przygotowanej próbki delikatnie usuwano rozpuszczalnik parami azotu, tak aby na ściankach powstała cienka warstwa próbki. Następnie do osuszonej mieszaniny dodawano 1 ml 0,1 M buforu sodowo - cytrynianowego o pH 5,2. Tak otrzymane liposomy poddawano pomiarowi dynamiki molekularnej techniką EPR.
komentarze
Copyright © 2008-2010 EPrace oraz autorzy prac.